Origen de la electroforesis
Electroforesis
La electroforesis es la separación de partículas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Un físico Ruso Alexander Reuss hizo las primeras observaciones del principio de la electroforesis en 1807. En la aplicación del campo eléctrico a una suspensión de arcilla en agua, el observó que las partículas de arcilla se movían hacia el polo positivo. Las observaciones de que las partículas con carga positiva se movían hacia el polo negativo y las partículas con carga negativa se movían hacia el polo positivo fueron confirmadas por Michael Faraday en Inglaterra y E.H. Bosi-Raymond en Alemania. También se observó que la mayoría de las partículas son ubicadas con cargas son más rápidas en su movimiento y que el número de cargas en exceso en las partículas y el voltaje de la corriente aplicada también afecta la velocidad de su movimiento. Adicionando un acido, base, sal o un electrolito a la solución se supera la dificulta de aumentar la conductividad eléctrica de la solución.
Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es un método que separa (basado en el tamaño, carga eléctrica y otras propiedades físicas) macromoléculas tales como ácidos nucleídos y proteínas. El término electroforesis es usado para describir la migración de una partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico. Por tanto a lo que se refiere la electroforesis en gel es la técnica en la cual las moléculas son forzadas a través del gel ubicado en un espacio entre dos límites (extremos), motivado por una corriente eléctrica. En cada uno de los extremos del gel hay electrodos activados que suministran la fuerza de atracción. Por tanto unas propiedades de la molécula especialmente la posesión de grupo ionizables, determina como rápidamente un campo eléctrico puede mover la molécula a través de un medio gelatinoso.
Una aplicación muy importante para la electroforesis en gel es en la tecnología del ADN.
La electroforesis en gel es una de las más importantes herramientas en biología molecular y es de valor crítico en muchos aspectos de la manipulación y estudio genético. Un uso es la identificación de moléculas ADN particulares por los patrones de banda que ellos producen en la electroforesis en gel después se der cortado con varias enzimas de restricción. ADN viral, plasmídico y segmentos particulares de ADN cromosomal puede ser identificados por esta técnica. Otro uso es la separación y purificación de fragmentos individuales conteniendo genes interesantes, los cuales pueden ser recuperados del gel con actividad biológica completa.
La electroforesis en gel hace posible determinar la diferencia genética y la relación evolutiva entre especies y plantas y animales. Usando esta tecnología es posible separara e identificar las proteínas que difieren en por lo menos en un solo aminoácido.
Detección de ADN a través de electroforesis en gel
Objetivo: detección del ADN a través de electroforesis en gel
Principio
La electroforesis se refiere al movimiento de moléculas cargadas bajo un campo eléctrico. Usando geles de agarosa o poliacrilamida se lleva a cabo la electroforesis. Los geles de agarosa son más porosos (100-300nm) que los de acrilamida. Sin embargo, el tamaño del poro depende de la concentración de agarosa. Por tanto, la agarosa es usada para separar macromoléculas de tamaño grande como el ADN y ARN. La concentración del gel de agarosa depende del tamaño del ADN, y las moléculas del plásmido. Entre más grande sea el peso molecular del ADN, ARN o plásmido se requiere menos concentración de gel de agarosa. Las moléculas de ADN y ARN están cargadas negativamente y se mueve hacia el ánodo (con carga positiva) cuando un campo eléctrico es aplicado. Este movimiento depende del tamaño, es decir el peso molecular de los ácidos nucleídos. De manera similar, diferentes tipos de plásmidos son también separados por este método. Un colorante llamado bromuro de etidio es usado para detectar el ADN. Este se intercala con el ADN. Por tanto, la localización del ADN puede ser detectada y visualizada cuando estas producen fluorescencia cuando se ponen bajo la luz ultravioleta.
Requerimientos para realizar la detección del ADN por electroforesis en gel de agarosa
(i) Secuencia de DNA
(ii) Gel de agarosa, acido bórico, Tris1, EDTA o ácido etilendiaminotetraacético , sacarosa, agua destilada, bromuro de etidio, glicerol
(iii) Azul de bromofenol, tubo Eppendorf (tubo pequño de base cónica para micentrífuda de aproximadamente 1.5 ml de capacidad empleado para almacenar pequeñas cantidades de líquido), micropipeta, horno microondas, agitador magnético.
(iv) Aparato electroforético con fuente de energía.
(v) Buffer [los dos buffer comúnmente usados son Tris-borato-EDTA (TBE) y Tris-acetato-EDTA (TAE)]. Su preparación se muestra a continuación:
Preparación del buffer para la detección de ADN por electroforesis en gel de agarosa
- 5X TBE titulación 1 con pH 8.0 se usa: 27.5g de acido bórico, 54g de Tris y 20ml de EDTA 0.5M.
- 5X TAE titulación 1 con pH 8.0 se usa: base Tris (24.2g), acido glacial (5.7ml) y 10ml de EDTA 0.5M.
- EDTA (0.5M, pH 8.0, 100ml).
- Solución de bromuro de etidio (disolver 10mg/ml en agua, envolver con papel aluminio y almacenar a 4°C). Mientras usa el bromuro de etidio usar guantes ya que es mutagénico.
- 6X gel-bromuro con carga IX (90.15% de azul de bromofenol, 0.15% de cianol, 30% (v/v) de glicerol en agua). De manera alternativa preparar colorante de 10X (66mg de sacarosa, 4.2mg de azul de bromofenol y 1ml de búfer).
Procedimiento
(i) Disolver 0.8g de agarosa en 100 ml de TRE IX con calentamiento suave sobre un agitador magnético en un plato caliente (o microondas). Esto dará un gel de agarosa del 0.8%.
(ii) Enfriar el contenido anterior hasta 60°C y adicionar bromuro de etidio hasta obtener una concentración final de 0.5 μg/ml, mezclando apropiadamente.
(iii) Usar una cinta que tape o cubra ambos lados de la bandeja que mantendrá el gel.
(iv) Inserte el aparato similar a un peine de tal manera que haga un espacio entre el diente y la superficie de la bandeja de 1mm.
(v) Obtener un espesor del gel de 4-5mm, agregar la solución de agarosa en la bandeja. Cuidar de no generar burbujas en el gel. Mantenerlo por 30-40 minutos.
(vi) Remover suavemente el peine cuando el gel se ha solidificado. Remover las cintas y mantener la bandeja en el tanque de electroforesis.
(vii) Agregar TRE en las muestra de ADN en las ranuras del gel sumergido. Las muestras debe ponerse en el fondo de la ranura.
(viii) Conectar la línea eléctrica de tal manera que el terminal negativo debe estar en el extremo donde la muestra se ha cargado.
(ix) Iniciar la electroforesis a 60-100v hasta que el azul de bromofenol migre hasta el otro extremo del gel.
(x) Apagar y desconectar las líneas eléctricas. Retirar el gel de agarosa del tanque de electroforesis.
(xi) Observar este en un transiluminador ultravioleta. La secuencia de ADN separado como bandas son fluorescentes bajo la luz UV, el cual hace que se compruebe su presencia (detección).
Resultado
Mientras inicia la secuenciación del ADN en la agarosa, las bandas deben aparecer diferentes sin mancha. Al final del gel una notable contaminación de ARN es visualizado si el ADN no es tratado con RNasa o con tratamiento incompleto, el RNA se mueve más rápido que el ADN ya que tiene un tamaño pequeño.
1 Es el nombre abreviado del componente orgánico conocido como tris(hidroximetil) aminometano, de fórmula (HOCH2)3CNH2 utilizado en bioquímica ampliamente como un componente de soluciones buffer. En el siguiente extracto de la página <http://2008.igem.org/wiki/images/8/84/Protein_Buffers.pdf> se puede observar una preparación de este compuesto como solución buffer.
Electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa es un método usado en bioquímica y biología molecular para separar molecular ADN, o ARN basado en el tamaño sin embargo las proteínas pueden también ser separadas en geles de agarosa. La separación de las moléculas es lograda por el movimiento de las moléculas de acido nucleído cargadas negativamente a través de una matriz de agarosa en un campo eléctrico. Las moléculas más pequeñas se mueven más rápido y migran una distancia más larga que las moléculas mas grandes.
Aplicaciones de la electroforesis en gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa es principalmente usada en el análisis o separación de moléculas de ADN y ARN (aunque las proteínas pueden también ser separadas en geles de agarosa), sin embargo la separación también permite la purificación de tamaños específicos de ADNs después de la digestión de la enzima de restricción. Esta es usualmente usada en clonación para obtener plásmidos cortado, en los cuales la electroforesis en gel de agarosa separa los vectores cortados de los no cortados.
Por tanto los geles de agarosa permiten:
- La separación de la enzima de restricción que digiere el ADN incluyendo la secuencia de ADN, antes de la transferencia al método de hibridación Souther. Este es también frecuentemente usado para separar ARN antes transferirlo a la hibridación Nothern.
- Análisis de productos de PCR después de la reacción en cadena de polimerada para evaluar la amplificación del ADN objetivo.
- Permitir la estimación del tamaño de las moléculas de ADN usando un marcador de ADN o “ladder” (que contiene varios fragmentos de ADN de diferentes bandas), el cual contiene los fragmente de ADN de varios tamaños conocidos.
- Permite la estimación robusta de la cantidad de ADN y su calidad.
- La cantidad de ADN es estimada usando un “ladder” lambda que contiene cantidad específicas de ADN de diferentes bandas.
- La calidad del ADN es estimado por observación de la ausencia de rayas o fragmentos (o contaminación con bandas de ADN).
- Otras técnicas depende de la electroforesis en gel de agarosa para la separación de ADN incluye la detección de características distintivas o “fingerprinting” de ADN.
Ventajas y desventajas de la electroforesis en gel de agarosa
Las ventajas son que el gel es fácilmente vertido, no desnaturalizas las muestras y las muestras pueden ser también recuperadas.
Por otra parte, las desventajas son que los geles puede fundirse durante la electroforesis, el buffer puede agotarse, y diferentes formas de material genético pueden tratarse cuando su forma no es predecible.
Migración en gel de agarosa
El factor más importante es la longitud de la molécula de ADN, entre más pequeñas sean las moléculas viajan mas distancia. Pero la conformación de la molécula de ADB es también un factor importante. Para evitar este problema las moléculas lineales son usualmente separadas, tales como los fragmentos de ADN a partir de digestión por restricción, productos PCR a partir de ADN lineal, o ARNs. El aumento de la concentración de agarosa de un gel reduce la velocidad de migración y permite la separación de las moléculas de ADN más pequeñas. Entre más alto sea el voltaje, mas rápido migra el ADN. Pero el voltaje es limitado por el hecho de que este calienta y al final puede causar que el gel de funda. Los altos voltajes también disminuyen la resolución (por encima de aproximadamente 5 a 8 V/cm). La conformación de un ADN de plásmido que no ha sido cortado con una enzima de restricción se moverá con diferentes velocidades (de la más lenta a la más rápida): ADN plasmídico cortado en partes o con muescas, circular abierto, linealizado, o superenrollado.
Resolución de los límites de los geles de agarosa
Los geles de agarosa puede ser usado para la separación de fragmentaos de ADN oscilando desde 50 pares de bases a varias megabases (millones de bases) por electroforesis. Sin embargo, mas comúnmente la electroforesis en gel de agarosa es usada para separar ADN de PCR y clonación en el rango e 100bp a aproximadamente 15kb. Tiempo de operación son cerca de 30 minutos - 1 hora de tiempo. Los ADNs o ARNs pequeños (más pequeños que 100bp) son separación mejor por geles de poliacrilamida, sin embargo los geles de agarosa entre 2-3% puede ser adecuados para separadas aun los fragmente de 50bp a partir de ácidos nucleicos mucho más grandes. Recientemente sin embargo, se ha demostrado que hasta una diferencia de un par de base podría ser resuelta en un gel de agarosa al 3% con un medio con conductividad extremadamente bajo tales como 1mM de borato de litio (Brody, Calhoun, Gallmejer, Creavalle, Kern, 2004 citado por Ahmed, 2009). La electroforesis en gel de agarosa de ultra-rápida-alta-resolución de ADN y ARN usa un medio con conductividad de baja molaridad.
Porcentaje de gel de agarosa y rango de eficiencia de separación
Los geles de agarosa son mejores para la separación de moléculas grande de ADN, mientras que los altos porcentajes de los geles son mejores para los ADN pequeños.
Purificación de ADN con extracción con gel de agarosa
La electroforesis en gel de agarosa permite la separación y por tanto la purificación de ADN para clonación. Sin embargo, este por general requiere agarosa fundida de alta pureza si el DN es para ser extraído partir del gel.
Buffers usados en la electroforesis en gel de agarosa
Dependiendo del tamaño y la aplicación del ADN a someterse a electroforesis, diferentes buffers puede ser usado para electroforesis en gel de agarosa. El buffer TAE (o Tris Acetato EDTA) es el más común usado en electroforesis en gel de de agarosa. TAE tiene la capacidad buffer más baja de los buffer existentes, sin embargo TAE ofrece la mejor resolución para ADN más grandes. Sin embargo, TAE requiere un voltaje más bajo y más tiempo. No obstante, el buffer TAE (Tris/Borato/EDTA) es frecuentemente usado para los fragmenteos de ADN pequeños (con menos de 500bp). El borato de sodio o buffer SB es un nuevo buffer, sin embargo este es ineficiente para resolver fragmentos más grandes a 5kb. El buffer SB tiene ventajas en su baja conductividad, permitiendo voltajes más altos (de hasta 35V/cm). Esto podría permitir un tiempo de análisis más corto para la rutina de electroforesis.
Bibliografía
Ahmed, M. Biotechnology : A Text Book. Ed. Global Media. India. 2009. 56-57, 64-66pp.
